6 de enero de 2018 19:23 PM
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Aislamiento y detección molecular de cepas emergentes del virus del PED en Perú

Este virus causa la diarrea epidémica porcina, enfermedad gastroentérica aguda, caracterizada por diarrea acuosa, vómitos, deshidratación y pérdida de peso, con alta mortalidad en lechones.

Resumen

La diarrea epidémica porcina (PED), es una enfermedad emergente caracterizada por diarrea acuosa, vómitos y deshidratación severa que afecta a lechones menores de 7 días de edad causando 100% de mortalidad.

En el 2013 se observaron cuadros clínicos sugerentes a PED por lo que el objetivo del trabajo fue aislar y detectar molecularmente cepas del PEDV en granjas porcinas de Lima. Se colectaron 37 muestras de heces de lechones entre 2 y 21 días de edad resultando positivos a la prueba de inmunocromatografía.

El 97.1% (34/35) fueron confirmados por ReTi, RTPCR que amplifica un segmento de 101 pb del gen ORF3 del PEDv. El control y las muestras positivas mostraron un Ct entre 10 y 21 ciclos con una temperatura de disociación de 77.7°C.

Los virus TGEV y PPC fueron utilizados como controles negativos. El aislamiento fue realizado en células VERO-21. El 23.5% (8/34) de los inóculos mostraron efecto citopático.

Introducción

El virus de la diarrea epidémica porcina (PEDv, por sus siglas en inglés) es un miembro de la familia Coronaviridae, que posee un genoma ARN de una sola cadena, polaridad positiva y con envoltura (Song y Park, 2012).

Este virus causa la diarrea epidémica porcina (PED), enfermedad gastroentérica aguda, caracterizada por diarrea acuosa, vómitos, deshidratación y pérdida de peso, con alta mortalidad en lechones menores de tres semanas (Kim y Chae, 2000). Otro virus porcino que incluye este género es gastroenteritis transmisible (TGEv), cursa con cuadros clínicos similares a PED (Lin et al., 2015).

El genoma del PEDv es de 28 Kb aproximadamente y posee siete marcos de lecturas abiertas (ORFs, ‘open reading frame’) que codifican cuatro proteínas estructurales: espícula (Spike, S), envoltura (E), membrana (M) y la nucleocápsida (N), tres proteínas no estructurales (replicasa 1a y 1b) y el ORF3 (Song y Park, 2012).

La línea celular VERO (células epiteliales del riñón del mono verde africano – Chlorocebus sp) se utiliza para el aislamiento del virus. Sin embargo, la propagación exitosa del virus depende de la adecuada suplementación de una proteasa exógena en el medio de cultivo celular que permita hacerla infectiva (Shirato et al., 2011).

En el Perú, entre 2013 y comienzos de 2014 se observaron brotes de diarreas agudas severas, vómitos y deshidratación en lechones y marranas ocasionando el 90-100% de mortalidad en lechones.

En octubre de 2013, el Servicio Nacional de Sanidad Agraria (SENASA), a través de su boletín epidemiológico (SENASA, 2013), reporta la presencia del PEDv en el país en un trabajo conjunto con el Laboratorio de Virología de la Facultad de Medicina Veterinaria de la UNMSM, a través de la prueba molecular RT-PCR en tiempo real, pero sin estudios de aislamiento viral.

Por esta razón, el objetivo del presente trabajo fue aislar e identificar molecularmente cepas emergentes del PEDv en granjas porcinas de Lima.

Materiales y métodos

Se colectaron 37 muestras de heces y /o contenido intestinal de lechones con cuadros clínicos compatibles con PEDV de distintas granjas del departamento de Lima. La extracción y purificación de ARN se llevó a cabo con el kit comercial ‘QIAamp Viral RNA Mini Kit’ (Qiagen, EEUU).

Los productos obtenidos fueron almacenados a -70 °C hasta su utilización. La técnica de RT-PCR en tiempo real se llevó a cabo en dos pasos, utilizando el kit comercial ‘GoTaq® 2-Step RT-qPCR System’ (Promega, EEUU), y el termociclador MJ Research PTC-200 adosado al lector de fluorescencia Chrome 4 (BioRad, EEUU), siguiendo a las indicaciones del fabricante.

Se utilizaron cebadores específicos descritos por Wang et al. (2014). Como control positivo de PEDv se utilizó una secuencia de ADN complementario (ADNc) cedida por el SENASA del Perú proveniente de USDA-APHIS. Asimismo, para TGEv se utilizó la cepa Holland (SVANOVA, Suecia).

Para el aislamiento viral se utilizó la línea celular VERO-21 observando diariamente alguna evidencia de efecto citopático. Los aislados positivos y negativos fueron congelados para su confirmación por RT-PCR en tiempo real con el protocolo descrito anteriormente.

Resultados

El 97.1% (34/35) fueron confirmados por ReTi, RTPCR. El control y las muestras positivas mostraron un Ct entre 10 y 21 ciclos con una temperatura de disociación de 77.7°C. Los virus TGEV y PPC fueron utilizados como controles negativos. El 23.5% (8/34) de los inóculos mostraron efecto citopático.

La confirmación por ReTi,RT-PCR se obtuvo en el 50% (4/8) de las muestras aisladas con valores en el Ct entre 13.6 y 22.5. De igual manera, todas las muestras que hasta el 5o pasaje no evidenciaron ECP resultaron negativas al RT-PCR en tiempo real.

Discusión

La enfermedad fue reportada por primera vez en el Perú en setiembre de 2013 por SENASA y la FMVUNMSM (SENASA, 2013), mediante la prueba de RT-PCR en tiempo real, pero sin el aislamiento viral, prueba reconocida como ‘Gold standard’ para el reporte de una enfermedad cuando es considerada exótica para un país o región.

La prueba de screening fue la IHC que permitió diferenciar a PEDv de TGEv en una sola corrida. Esta prueba se hizo ya que se había reportado un brote de TGEv en lechones en 2012 (M. Ramírez, Lima, comunicación personal). El 94.3% (35/37) de las muestras resultaron positivas a PEDv por IHC, siendo probable que las dos muestras negativas tengan otro origen, ya que los signos clínicos gastroentéricos no son específicos a PEDv (Song y Park, 2012).

La prueba de RT-PCR dúplex en tiempo real permitió diferenciar a los virus de TGE y PED en una sola corrida, donde el 97.1% (34/35) de las muestras positivas a IHC resultaron positivas a PED.

La alta sensibilidad y especificidad de técnicas moleculares como el PCR, permite detectar hasta el 100% de animales infectados si se trabaja con muestras y protocolos adecuados, por lo que constituye la técnica más idónea para la detección viral frente a otras pruebas convencionales (Kim y Chae, 2002).

Diversos autores coinciden en la dificultad que representa el aislamiento viral para el PEDv (Wang et al., 2014). No obstante, se continúa realizando los ensayos correspondientes a fin de obtener un protocolo más eficiente que permita el aislamiento de mayor número de cepas del PEDv en el Perú.

Conclusiones

Se aislaron cuatro cepas de campo del virus de la diarrea epidémica porcina (PED) en células VERO-21 de lechones infectados provenientes de granjas de Lima.

Agradecimientos

Este estudio fue financiado por el Vicerrectorado de Investigación y Postgrado de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos (Proyecto N.° 140801011).

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Fuente: Agromeat

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