17 de enero de 2012 02:12 AM
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TBC en terneros: resultados de un estudio prospectivo

Materiales y Métodos

Historia del rodeo lechero

El estudio se realizo sobre un rodeo lechero con TB endémica, que presentó una prevalencia en vacas adultas de entre el 0,8 y el 2,7% durante el período en estudio (enero 2010 a enero 2011). El mismo, estaba conformado por 261 vacas totales y 250 bovinos en recría de entre 2 y 24 meses de edad distribuidos en una superficie de 436 Ha. El rodeo mantenía un historial de reactores positivos a la PAC en vacas sin poder concretar el saneamiento y en los cuatro años previos a este estudio presentó una incidencia de TB en terneros que osciló entre el 10 y el 95 %.

Diseño del estudio

Se realizo un estudio observacional de cohortes con dos grupos de terneros, de los cuales uno fue expuesto al factor (consumo de leche cruda). Luego del parto, los teneros eran mantenidos en un piquete durante 24 horas con sus respectivas madres, para promover el consumo natural de calostro. Posteriormente, ambos grupos de terneros fueron criados artificialmente durante los 2 a 90 días de edad. El grupo expuesto consumió leche cruda procedente de una mezcla de leche de vacas del rodeo general y el grupo no expuesto consumió sustituto lácteo. El consumo de leche o de sustituto lácteo fue de 4 litros/animal/día suministrado en dos tomas diarias. Ambos grupos recibieron además agua ad libitum y alimento sólido. Cada ternero fue sujeto al suelo por una estaca y separados entre sí de manera tal de no tocarse entre ellos. Los grupos fueron separados espacialmente por 50 metros. Todos los terneros fueron alimentados por la misma persona, comenzando primero por el grupo no expuesto y continuando luego por el grupo expuesto. Se consideró que todos los terneros eran sanos al momento de comenzar la crianza artificial.

Prueba de la tuberculina

Al finalizar el período de crianza artificial los terneros fueron inoculados con 0,1 mL de DPP de M. bovis (PPD BOVINA, Sanidad Ganadera S.R.L.) en forma intradérmica y 72 ± 6 h después se evaluó la presencia de edema, eritema o induración. Se utilizo un calibre para cuantificar el tamaño del pliegue ano-caudal previo y posterior a la inoculación. Un aumento del tamaño en el pliegue ano-caudal mayor o igual a 3 mm fue el indicador de reacción positiva a la PAC (PAC-positivo). La edad de los terneros sometidos a la PAC era de entre 60 y 90 días y todas las pruebas fueron realizadas por el mismo veterinario. Una respuesta PAC positiva fue considerada como un indicador de exposición a M. bovis.

Estudios complementarios

Al finalizar el ensayo se sometió a 25 terneros positivos a la PAC a la prueba cervical comparada (PCC) utilizando 0,1 mL DPP de M. bovis, M. avium, M. fortuitum y M. plhei, estas dos últimas tuberculinas fueron elaboradas con cepas aisladas del ambiente. En la región cervical media se rasuro una zona de 15 cm2 y se inyecto DPP en forma intradérmica en cuatro puntos distanciados por 12 cm. El pliegue de piel cervical fue medido previo y 72 ± 6 h posteriores a la inoculación.

Un ternero PAC-positivo fue sometido a necropsia para intentar aislar e identificar el M. bovis. Se tomaron muestras para bacteriología de los ganglios retrofaríngeos, mediastínicos, traqueo-bronquiales, mesentéricos, hepáticos y del pulmón. Todo crecimiento micobacteriano fue analizado por la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR IS6110) y la tipificación de oligonucleótidos espaciadores (Spoligotyping).

Para evaluar la presencia de M. bovis en el ambiente se tomaron muestras del agua suministrada a los terneros y que es utilizada para la preparación del sustituto lácteo. Asimismo, se tomaron muestras de suelo de la capa superficial de tierra donde el grupo expuesto y no expuesto fueron mantenidos durante la crianza artificial. Las mismas se incubaron a 25, 37 y 42 ºC durante dos meses. A todo crecimiento de micobacterias se le realizo la tipificación molecular mediante análisis de los productos de amplificación y restricción (PRA) de un segmento del gen del hsp65 y la secuenciación parcial del gen que codifica para el 16S RNA.

Análisis de los datos

La descripción del tiempo y el tamaño del pliegue ano-caudal son expresados por la media y desvío estándar (M ± DE). Se utilizo el riesgo relativo para medir el grado de asociación en el factor de exposición y los resultados y la prueba de chi-cuadrado para determinar la significancia de la asociación. Se calculo el riesgo atribuible a la exposición, es decir, la incidencia de la enfermedad que se hubiera evitado si los animales no hubieran estado expuestos al factor de riesgo, asumiendo que el factor es causal. Asimismo, se calculo la fracción atribuible, que es la proporción de la exposición atribuible al factor de exposición (Thrusfield, 2007). Los datos fueron analizados con el software Win episcope 2,0.

Resultados

Prueba de la tuberculina

Un total de 108 terneros fueron evaluados, de los cuales 58 pertenecían al grupo expuesto y 50 al grupo no expuesto. La edad de los terneros sometidos a la PAC fue de 92 ± 29 días y 86 ± 20 para el grupo expuesto y no expuesto respectivamente. La incidencia de terneros PAC-positivos fue del 65% (n = 38) y el 46% (n = 23) para el grupo expuesto y no expuesto respectivamente (¡Error! No se encuentra el origen de la referencia.). El tamaño de reacción promedio de los terneros PAC-positivos fue de 14 ± 4 mm. El riesgo relativo fue de 1,4 (IC 95% = 1 – 2; P = 0,04), es decir que, los terneros que consumieron leche cruda tuvieron un 40% más de riesgo de ser expuestos a M. bovis en relación a aquellos terneros que consumieron sustituto lácteo. El riesgo atribuible a la exposición fue del 19%. Es decir que, un 19% de la incidencia se hubiera evitado si los terneros no hubieran consumido leche cruda. En términos relativos, la proporción atribuible al consumo de leche cruda fue del 28%. Es decir que, en este estudio, no se pudo demostrar cuál fue la fuente de infección a la cual atribuirle el 72% de las infecciones en los terneros expuestos.

Estudios complementarios

Todos los terneros que fueron sometidos a la PCC, fueron positivos a M. bovis y negativos a las demás tuberculinas. La diferencia en el tamaño del pliegue cervical pre y post-inoculación fue de: 10,8 ± 4 mm para M. bovis; 4,4 ± 2 mm para M. avium; 1 ± 1 mm para M. fortuitum y 2,6 ± 2 mm para M. plhei.

Del ternero sometido a necropsia se logro aislar e identificar M. bovis del tejido pulmonar. No se observaron lesiones macroscópicas en la cadena ganglionar digestiva pero si una importante afección de los lóbulos medios de ambos pulmones.

No se identificó el crecimiento de M. bovis en muestras de suelo y agua. Sin embargo, se logró aislar e identificar micobacterias no tuberculosas (MNT) en el agua utilizada para la alimentación de los terneros (20-40 UFC/mL) y el suelo (2 x 102 UFC/gr.) sobre el cual los animales eran criados. La tipificación molecular demostró un perfil de restricción concordante con Mycobacterium simiae, confirmándose por 16S RNA, cuya secuencia demostró una identidad del 99,7%.

Discusión

Este estudio demostró que en este rodeo lechero, la alimentación con leche cruda estuvo asociada a la exposición a M. bovis en terneros de entre 60 y 90 días de edad. Sin embargo, la elevada incidencia observada en ambos grupos de terneros sugiere que las condiciones epidemiológicas de este rodeo fueron inusuales. Se encontró que los terneros que consumieron leche cruda tuvieron un 40% más de riesgo de ser expuestos a M. bovis que aquellos terneros que consumieron sustituto lácteo. Sin embargo, solo el 19% de la incidencia de TB en el grupo expuesto puede atribuírsele al consumo de leche cruda, habiendo una gran proporción de terneros en los cuales no se logró determinar la fuente de infección. Es por ello que los valores obtenidos deben interpretarse considerando la elevada incidencia observada en el grupo no expuesto, que sugiere que otros factores no identificados en este estudio estarían involucrados en la transmisión de la infección.

Los resultados demuestran que los terneros de ambos grupos presentaron una elevada incidencia de TB, aunque la misma fue mayor en el grupo expuesto. Aunque algunos autores indican que la diseminación por leche es baja, las nuevas técnicas más sensibles demuestran que su importancia en la diseminación de M. bovis por leche habría sido subestimada. Una sola vaca puede excretar una gran cantidad de bacterias por leche lo cual puede ser suficiente para hacer infectiva a una mayor cantidad de la misma (Moda et al., 1996). La incidencia en el grupo expuesto de este estudio duplicó la prevalencia de grupos de terneros de alto riesgo encontrado en otro trabajo, bajo situaciones similares (Evangelista and De Anda, 1996). Es posible que animales anérgicos puedan haber estado excretando una gran cantidad de M. bovis a través de la leche, y que los mismos no hayan sido detectados por las pruebas convencionales. Evitar el consumo de leche cruda podría disminuir en un 19% la incidencia en terneros de rodeos endémicos, por lo que es una medida preventiva a considerar en los planes de saneamiento.

El consumo de leche cruda ha sido desde siempre, un reconocido factor de riesgo para la ocurrencia de tuberculosis en humanos producida por M. bovis (OReilly and Daborn, 1995; Abalos and Retamal, 2004), especialmente en niños, debido aparentemente a una mayor susceptibilidad relacionada a la edad (Moda et al., 1996). Es por ello que, el hallazgo de este estudio implica que la leche puede representar un gran riesgo para aquellas personas que están expuestas al consumo de leche bovina sin el tratamiento térmico adecuado.

Este trabajo encontró además que, el riesgo de que los terneros se expongan a M. bovis, no se eliminó completamente con el uso de sustitutos lácteos. A una conclusión similar llegaron otros investigadores (Evangelista and De Anda, 1996) que encontraron reactores positivos en terneros alimentados con sustitutos lácteos. Esto también sugiere que otras vías de transmisión no evaluadas en este estudio estarían involucradas en la transmisión de la infección. La transmisión en el grupo no expuesto podría haber ocurrido por vía congénita, por la ingestión de calostro de vacas falso negativas a la PAC y/o por contagio directo de su madre inmediatamente después del parto. También es factible que algunos terneros se hayan infectado al consumir calostro de vacas con TB y que los mismos hayan actuado como fuente de infección para otros terneros durante la etapa de crianza artificial.

La elevada incidencia de terneros PAC-positivos encontrada en ambos grupos fue inesperada, y difiere de la baja prevalencia registrada en vacas adultas. La TB se describe generalmente como una enfermedad crónica y es tal vez por ello que, debido a su relativa longevidad, las vacas tienen más probabilidad de ser expuestas a M. bovis que las categorías más jóvenes, pero esto no concuerda con nuestros resultados. Se desconoce el rol que podrían haber tenido las especies silvestres y/o demás especies domésticas presentes en el establecimiento en la transmisión de la enfermedad. Algunos países han tenido serios impedimentos en la erradicación de la TB debido al contacto de los bovinos con animales silvestres (Collins, 2006) aunque en nuestro estudio esta situación no fue considerada.

Las pruebas complementarias utilizadas refuerzan los resultados de la PAC indicando que, la bacteria que causo las reacciones positivas en estos terneros fue M. bovis. La concordancia entre la PAC y la PCC fue total, lo cual asegura una mayor confiabilidad en los resultados de la PAC. En al menos un espécimen pudo identificarse el agente causal, lo cual refuerza drásticamente los resultados. Dicho animal no presentó lesiones macroscópicas en la cadena ganglionar intestinal pero si una marcada afección pulmonar, de la cual se pudo aislar el M. bovis. Esto sugiere que la vía de infección de este ternero fue respiratoria y no digestiva, lo cual refuerza la hipótesis de la presencia de otras fuentes de infección que habrían estado involucradas en la transmisión. La ausencia de M. bovis en el ambiente sugiere que el mismo no representaría un riesgo para la transmisión de la infección en terneros. El M. bovis tiene además una sobrevivencia limitada en el ambiente a diferencia de otras bacterias como las que producen el carbunclo o el tétano. Mientras que, la presencia de MNT en suelo y agua sería un hallazgo esperable aunque su importancia radicaría en que podrían producir reacciones inespecíficas a la prueba de la tuberculina (Oriani and Sagardoy, 2005). La micobacteria identificada (M. simiae) puede estar presente en el ambiente y causar una infección progresiva en humanos (Barrera et al., 2010; Oldrino et al., 2010), por lo que su importancia en bovinos debería ser evaluada. La evidencia recabada por las pruebas complementarias confirma que el M. bovis estaba presente en terneros PAC-positivos y sugieren que el ambiente no habría sido un factor influyente sobre la transmisión de la infección.

Para un eficiente control y erradicación de la TB es importante identificar todas las potenciales fuentes de infección para proceder a su remoción y evitar de esta manera la persistencia de M. bovis en el rodeo. De igual manera, es importante aplicar la prueba de la tuberculina a las categorías más jóvenes con el fin de identificar rápidamente a aquellos animales que pueden convertirse en los potenciales reservorios y fuentes de infección para el rodeo. Los terneros nacidos de madres positivas a la tuberculina deberían ser separados luego del parto y suministrarles calostro de vacas negativas a la prueba diagnóstica. Mientras que, el uso suministro de sustitutos lácteos, reduciría de manera significativa la exposición a M. bovis en terneros lactantes.

Es importante destacar que los resultados de este estudio prospectivo sólo son aplicables a este rodeo lechero. No obstante, son indicativos de la complejidad que puede existir en algunos rodeos endémicos que intentan concretar el saneamiento de TB. Por este motivo, nuevos esfuerzos deberán abordarse para intentar identificar otras potenciales vías de transmisión, conforme progresen los esfuerzos para controlar y erradicar la TB de nuestros rodeos.

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